細胞實驗 | 腫瘤細胞侵襲實驗的開展

腫瘤細胞侵襲能力檢測在腫瘤學(xué)（遷移、侵襲）和免疫學(xué)（遷移、趨化）中是常規(guī)實驗。侵襲是細胞遷移的一種。細胞遷移分三種類型：趨觸、趨化和侵襲。腫瘤細胞的侵襲性是腫瘤相關(guān)信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學(xué)研究的一個重要指標。

為了對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有更加清晰的理解，我們先來了解一下，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的過程，主要包括以下5個過程：原位侵襲，腫瘤細胞內(nèi)滲，循環(huán)系統(tǒng)存活，腫瘤細胞外滲，形成轉(zhuǎn)移灶等。其中細胞侵襲便發(fā)生在第一步，即腫瘤細胞在原位突破基底膜，然后內(nèi)滲進入血管、淋巴管的過程，后期才開始進行轉(zhuǎn)移。

實驗原理

簡單來說，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，并將高營養(yǎng)液與低營養(yǎng)液用一層膜隔開，并在膜上室鋪基質(zhì)膠，用來模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)。腫瘤細胞放在低營養(yǎng)液中，為了獲得更多的營養(yǎng)吃的更飽，這些細胞需先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，才能穿過這層膜，進入高營養(yǎng)液，最后通過計數(shù)下室的細胞量即可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

實驗方法

1、復(fù)蘇代數(shù)靠前的腫瘤細胞，在含有10% FBS的培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)2-3代，待細胞匯合達到80%左右，饑餓處理18-24小時。

2、準備鋪膠：

a）4 °C溶matirgel膠過夜

b）將細胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預(yù)冷

c）用無血清的冷培養(yǎng)基稀釋matirgel膠至一定濃度，加入到細胞小室的上層（按照產(chǎn)品說明書的推薦比例和體積），輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進行

d）立即將鋪好matrigel膠的細胞小室置于培養(yǎng)板中，于37°C孵育1小時左右，matirgel膠可由液體凝成固體，吸走多余的或者未凝的膠

3、細胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的無血清培養(yǎng)基中和，1500rpm離心5-10min。

4、用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度

5、取上述細胞液加入小室，下室（培養(yǎng)板）加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同，具體參考產(chǎn)品說明書

6、37 °C孵育24至72小時，依據(jù)腫瘤細胞類型而定

7、孵育結(jié)束，小心取出細胞小室，吸掉小室上層培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%結(jié)晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后進行第8步或者第9步。

8、PBS清洗兩次以去除多余的染料，立即用棉簽擦去濾膜上層的細胞，自然靜置風干。顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞，隨機選取不同的視野計數(shù)并算平均值。

9、結(jié)晶紫溶解濾膜下層細胞，然后用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細胞穿透不均勻帶來的誤差。

10、計數(shù)：Transwell侵襲實驗結(jié)果統(tǒng)計分析有兩種方法

直接計數(shù)法：通過給細胞染色，直接在鏡下計數(shù)。選擇不同的視野拍照（一般選擇呈現(xiàn)視野中穿過的細胞），計數(shù)的結(jié)果可做成統(tǒng)計圖，輔助呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。

間接計數(shù)法：主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。它包括：MTT法、 熒光試劑檢測、 結(jié)晶紫檢測。

注意事項

1、腫瘤細胞最好經(jīng)過饑餓處理，并且小室上下培養(yǎng)基的FBS有濃度差，以保證細胞可以穿透基質(zhì)膠。

2、鋪細胞要均勻，濾膜底部不能產(chǎn)生氣泡，否則會導(dǎo)致細胞染色不均勻，或者局部細胞無法穿透。

3、侵襲實驗的細胞密度比較大，不同腫瘤細胞的接種密度、培養(yǎng)時間不同，需要實驗摸索。細胞太少，遷移不過去；細胞太多，可能導(dǎo)致正常組和實驗組無差異。

4、首次做實驗需要用正常的細胞摸索合適的細胞密度和培養(yǎng)時間，確定之后再加實驗組，同時如果條件允許，設(shè)置一組已知高遷移性的細胞作陽性對照。

5、注意細胞小室內(nèi)外培養(yǎng)基的比例，不要使小室外培養(yǎng)基超過小室內(nèi)培養(yǎng)基液面。

6、觀察細胞時一定要擦去小室內(nèi)部貼在膜上的細胞。